Agrarforschung
Untersuchungen und Prüfung von Optimierungsmöglichkeiten zum Einsatz biochemisch-genetischer Methoden zur Herkunftssicherung bei einheimischen Nebenbaumarten

Dr. Erwin Hussendörfer, Forstliche Versuchs- und Forschungsanstalt; Freiburg, Abteilung Botanik und Standortskunde
Juli 1999 - Dezember 2001

Problemstellung

Nach den derzeitig gültigen rechtlichen Bestimmungen (vgl. FSaatG 1979 und hierzu ergangene Durchführungsverordnungen) darf bei der Kunstverjüngung (Anbau, Vorbau) nur Vermehrungsgut aus amtlich zugelassenen Saatguterntebeständen oder Samenplantagen verwendet werden, welches von einer vorgeschriebenen Anzahl an Samenbäumen abstammt. Für die Herkunftskontrolle stellen sich in diesem Zusammenhang folgende wichtige Fragen:

(A ) Ist die vorgeschriebene Anzahl an zu beerntenden Bäumen bzw. Klonen je Beerntungseinheit eingehalten worden?

(B) Stammt ein im Handel erhältliches Vermehrungsgut tatsächlich von dem auf dem Begleitschein angegebenem Beerntungseinheit ab?.

Mit Hilfe biochemisch-genetischer Methoden (Isoenzym-Analysen, DNA-Analysen) ist es in gewissem Umfang möglich, die vom Gesetzgeber geforderte Herkunftssicherheit forstlichen Vermehrungsgutes zu kontrollieren. Eine wesentliche Er-gänzung zu den personenbezogenen Kontrollver-fahren (Überwachung der Ernte, Angaben von Begleitscheinen, Betriebsbesichtigungen) ergibt sich dadurch, daß die Kontrolle lückenlos erfolgen kann, d.h. unabhängig vom Alter bzw. Entwicklungszustand des Vermehrungsgutes (Saatgut, Sämlinge, Pflanzen) und unabhängig vom Ort, an dem es sich befindet.

Biochemisch-genetische Methoden sind für die Hauptbaumarten (Fi, Ta, Ki, Dgl, Bu, StEi, TrEi) etabliert, und können unter bestimmten Voraussetzungen - insbesondere der Verfügbarkeit von Referenzproben - für verschiedene Fragestellungen zur Herkunftskontrolle eingesetzt werden. Für ein-heimische Nebenbaumarten allerdings, liegen erst wenige biochemisch-genetische Untersuchungen mit Isoenzym- und DNA-Methoden vor, so daß deren Möglichkeiten und Grenzen für Herkunftskontrollen unbekannt sind.

Ziel

Im Rahmen des Forschungsprojektes werden methodische und technische Fragestellungen für einen effizienten Einsatz biochemisch-genetischer Analysen zur Herkunftssicherung forstlichen Vermehrungsgutes untersucht. Weiterhin soll geprüft werden, inwiefern der Einsatz zweier verschiedener Methoden (Isoenzym-Analysen, DNA-Analysen) erforderlich ist. Die Untersuchungen erfolgen bei den forstlich bedeutsamen Nebenbaumarten Bergahorn, Spitzahorn, Esche, Roterle, Winterlinde und Vogelkirsche.

Untersuchungsmethode

Als biochemisch-genetische Methoden werden sowohl Isoenzym-Analysen als auch DNA-Analysen verwendet. Isoenzym-Analysen können bei den meisten Baumarten an 10 bis 14 Genorten durchgeführt werden. Für den Einsatz von DNA-Analysen können bei den Nebenbaumarten zur Zeit sog. "Micro-Satelliten" in der Chloroplasten DNA (cpDNA) eingesetzt werden, die aufgrund ihres uniparentalen Vererbungsmodus für Abstammungsuntersuchungen besonders geeignet sind.

Ergebnisse

Erste Ergebnisse liegen für die Baumart Linde vor. Für diese Baumart wurden 46 Klone einer Winterlinden-Samenplantage untersucht.

(1) Isoenzymanalyse

Mit Hilfe der horizontalen Stärkegelelektrophorese (Isoenzym-Analyse) konnten bei der Baumart Linde 15 polymorphe Genorte identifiziert werden. Sieben dieser 15 Genorte (AP-D, FDH, MDH-C, MNR, PGI-C und -D sowie PGM-A) konnten mit absoluter Sicherheit ausgewertet werden, bei den restlichen 8 Genorten kann eine geringe Fehlerquote bei der Interpretation nicht ausgeschlossen werden.

Artbestimmung

Aufgrund artspezifischer Allele, die eine Unterscheidung zwischen Winter- und Sommerlinden sowie deren Hybriden ermöglicht, konnte nachgewiesen werden, dass es bei dem vorliegenden Untersuchungsmaterial ausnahmslos um Winterlinden handelt.

Klonidentifikation

Unter Berücksichtigung der 7 einwandfrei auswertbaren Genloci zeigten 23 Klone Übereinstimmung in ihrer Genotypstrukturen. Bei Betrachtung auch der übrigen 8 untersuchten Genloci unterscheiden sich aber auch diese in ihrem Genotypstruktur. Mit einer hohen Wahrscheinlichkeit ist daher davon auszugehen, dass die untersuchten Klone nicht von genetisch identischem Material stammen und unterschieden werden können.

(2) DNA-Analysen

Zunächst wurde die DNA aus den Knospen von 46 Winterlinden-Klonen isoliert. Für die Isolierung wurde der DNeasy Plant Mini Kit der Fa. Qiagen benutzt. Im Gegensatz zu jungen Blättern, gestaltete sich die DNA-Isolierung aus den Knospen recht schwierig, offensichtlich besitzen die Knospen einen sehr hohen Polysaccharidanteil. Damit wurde eine weitere Reinigung notwendig, um die auf PCR-basierenden Marker zu testen.

Von den getesteten primer-Paaren lieferten nur die primer trnD/trnT und trnL/trnF ein Amplifizierungsprodukt und zwar für die DNA der verschiedenen Klone einheitlich von etwa 1000 bzw. 1100 Basenpaare Länge. Die Amplifizierungsprodukte wurden für die PCR-RFLP-Analyse mit folgenden Restriktionsenzymen geschnitten:

trnD/trnT mit: Hae III; Taq I; Rsa I; Hinf I

trnL/trnF mit: Hae III; Taq I; Rsa I; Hinf I

Die Kombination trnL/trnF mit Taq I lieferte Polymorphismen, so dass insgesamt 4 verschiedene Cyto-Typen unterschieden werden können.

Die folgende Prüfung ergab, dass die Poly-morphismen nur bedingt für die Klonunterscheid-ung geeignet sind, da 31 Klone den Cyto-Typ 1 aufwiesen, 5 Klone den Cyto-Typ 2, 3 Klone den Cyto-Typ 3 und 4 Klone den Cyto-Typ 4.

Eine eindeutige genetische Identifizierung der Klone ist demnach mit Hilfe der DNA-Marker nicht möglich.

Ergebnisse

Für den Einsatz biochemischgenetischer Methoden im Rahmen der Herkunftssicherung erwiesen sich bei der Baumart Linde Isoenzyme als geeignete Genmarker. Ihr Einsatz muss für weitere Samenerntebestände und Saatgutproben optimiert werden.

Literatur
Siehe Abschlußbericht

MLR   |   Agrarforschung